DIN CEN/TS 15633-3 ; DIN SPEC 10700-2:2012-10
Lebensmittel - Nachweis von Lebensmittelallergenen mit immunologischen Verfahren - Teil 3: Quantitative Bestimmung von Haselnuss mit einem Enzym-Immunoassayverfahren unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern und Proteindetektion nach Lowry; Deutsche Fassung CEN/TS 15633-3:2012

Titel (englisch)

Foodstuffs - Detection of food allergens by immunological methods - Part 3: Quantitative determination of hazelnut with an enzyme immunoassay using polyclonal antibodies and Lowry protein detection; German version CEN/TS 15633-3:2012

Verfahren

Vornorm

Einführungsbeitrag

Die Haselnuss (Corylus avellana) gehört zu einer Gruppe von Lebensmitteln, die im Allgemeinen als Baumnüsse bezeichnet werden. Allergische Reaktionen auf Haselnuss, die vom oralen Allergiesyndrom bis zur schweren Anaphylaxie reichen, wurden ausführlich in Berichten dargelegt. Nach der Gesetzgebung zur Lebensmittelkennzeichnung ist in einer Vielzahl von Nationen der Europäischen Union, Nordamerikas, Asiens und Australasiens eine Angabe zum Vorliegen von Haselnuss in Lebensmitteln erforderlich. Untersuchungen zur IgE-Bindung am Serum von sensibilisierten Patienten haben eine Reihe von Allergenen aufgedeckt, einschließlich sowohl Pollen- als auch Nicht-Pollen-Allergene. Bei Untersuchungen zur Schwellendosis wurden so geringe Provokationsdosen wie 1 mg Haselnussprotein in Berichten angeführt. Haselnusshaltiges Material kann aus verschiedenen Gründen unbeabsichtigt in Lebensmitteln auftreten. Es kann in kontaminierten Zutaten vorliegen oder aufgrund einer während der Herstellung des Lebensmittels aufgetretenen Kreuzkontamination. Folglich besteht ein Bedarf an empfindlichen und zuverlässigen Untersuchungsverfahren zum Nachweis von Haselnuss in Lebensmittelproben. Die DIN SPEC 10700-2 (CEN/TS 15633-3) legt ein ELISA-Verfahren (enzymgebundener Immunosorbent-Test, en: Enzyme-linked Immunosorbent Assay) zur Bestimmung der Haselnusskonzentration in Lebensmittelproben fest. Zur Validierung der Anwendung des Verfahrens auf Lebensmittelmatrices, wie zum Beispiel Mehrkorn-Zerealien, feinherbe Schokolade (45 % Kakao) und Eiscreme, wurden Aufstockversuche unter Verwendung von verdünnter gemahlener Haselnuss durchgeführt. Der Bereich des Verfahrens reicht von 0,5 mg bis 5,0 mg Haselnussprotein je kg Lebensmittelprobe. Da Haselnusskerne üblicherweise zwischen 12 % bis 15 % Protein enthalten, entspricht das etwa 3,7 mg bis 37 mg Haselnusskernen je kg Lebensmittelprobe. Die obere Grenze des Quantifizierungsbereichs kann bei Bedarf durch weitere Verdünnung von Probenextrakten erweitert werden. Das Verfahren ist im Handel erhältlich und wurde vom Hersteller intern validiert. Die Daten sind in Anhang A.2 enthalten. Das Verfahren wurde in einem Ringversuch erfolgreich validiert. Der Versuch wurde von der Arbeitsgruppe organisiert, die vom Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) zur Durchführung von § 64 des Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futtermittelgesetzbuches (LFGB) für die Bestimmung des Haselnussgehaltes in feinherber Schokolade eingerichtet wurde. Es nahmen 13 deutsche Laboratorien teil. Die Daten sind in Anhang A.3 enthalten. Für den Nachweis von Haselnussprotein wird ein direkter enzymgebundener Immunosorbent-Test (ELISA) in Form eines Sandwichtests verwendet. Unter Anwendung einer Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurde eine Proteinbande bei 13 kDa bis 14 kDa ermittelt, die sowohl bei rohen als auch bei gerösteten Haselnüssen vorliegt. Dieser Proteinmarker wurde mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gereinigt und zur Erzeugung von polyklonalen Kaninchen-Antiseren gegen Haselnussprotein verwendet. Die IgG-Fraktion dieses Antiserums wurde mit Affinitätschromatographie gereinigt und anschließend wie nachstehend beschrieben für die Entwicklung eines direkten Sandwich ELISA verwendet. Zur Messung der optischen Dichte (OD) jeder Kavität wird ein Spektrophotometer (Primärwellenlänge 450 nm und Referenzwellenlänge zwischen 620 nm und 650 nm) eingesetzt. Die erzeugte OD wird durch die Konzentration des Haselnussproteins bedingt. Die Haselnusskonzentration einer Probe kann durch Vergleich der durch die Probe erzeugten OD mit der durch Standards erzeugten OD berechnet werden. Die Standards werden in mg Haselnussprotein je kg kalibriert. Sie wurden aus einem wässrigen Extrakt handelsüblicher Haselnüsse (Corylus avellana) hergestellt. Die Proteinkonzentration wurde nach dem Lowry-Verfahren bestimmt. Für dieses Dokument ist das Gremium NA 057-01-05 AA "Lebensmittelallergene" im DIN zuständig.