DIN EN 15851
Lebensmittel - Bestimmung von Aflatoxin B₁ in Säuglings- und Kleinkindernahrung auf Getreidebasis - HPLC-Verfahren mit Reinigung an einer Immunoaffinitätssäule und Fluoreszenzdetektion; Deutsche Fassung EN 15851:2010
Foodstuffs - Determination of aflatoxin B₁ in cereal based foods for infants and young children - HPLC method with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection; German version EN 15851:2010
Einführungsbeitrag
Mykotoxine sind stark gesundheitsschädliche sekundäre Stoffwechselprodukte von Schimmelpilzen. Lebensmittel, die unter feuchten Bedingungen angebaut, geerntet oder gelagert werden, können von Schimmelpilzen befallen werden, deren Stoffwechselprodukte dann in das Lebensmittel gelangen. Die Toxizität einiger Mykotoxine ist für den Menschen erheblich; deshalb ist ein sicherer Nachweis von besonderer Bedeutung für den gesundheitlichen Verbraucherschutz. In Deutschland gilt zur Verringerung der Mykotoxinbelastung die Mykotoxin-Höchstmengenverordnung. Sie enthält seit 2004 nicht nur Regelungen für Aflatoxine, sondern auch für Ochratoxin A, Fumonisine, Deoxynivalenol und Zearalenon. Seit 2001 werden die nationalen Bestimmungen durch EU-weit geltende Höchstgehaltregelungen für Kontaminanten in Lebensmitteln ergänzt. Höchstgehalte an Mykotoxinen in bestimmten Lebensmitteln werden außerdem noch durch verschiedene andere Verordnungen geregelt. Aflatoxine sind natürlich vorkommende Mykotoxine, die erstmals beim Schimmelpilz Aspergillus flavus nachgewiesen wurden. Die Toxine werden aber auch von anderen Schimmelpilzarten wie Aspergillus parasiticus gebildet. Aspergillus flavus ist in der Natur weit verbreitet. Man kann daher Aflatoxine außer in Getreidesorten auch in Erdnüssen, Haselnüssen, Mohn, Feigen und Pistazien nachweisen. Man unterscheidet mindestens 20 natürlich vorkommende Aflatoxine, von denen Aflatoxin B1 als das für den Menschen gefährlichste gilt. Aflatoxine haben bei Konzentrationen um 10 µg/kg Körpergewicht akut lebertoxische Wirkung (Leberdystrophie), wirken jedoch schon bei geringeren Konzentrationen, vor allem bei wiederholter Aufnahme, karzinogen auf Nagetiere und Menschen. Die letale Dosis von Aflatoxin B1 beträgt bei Erwachsenen 1 mg/kg bis 10 mg/kg Körpergewicht bei oraler Aufnahme. Im Tierversuch mit Ratten (letale Dosis 7,2 mg/kg Körpergewicht) wurde die Karzinogenität einer Tagesdosis von 10 µg/kg Körpergewicht eindeutig nachgewiesen. Aflatoxin B1 ist damit eine der stärksten krebserzeugenden Verbindungen überhaupt. Die Höchstmenge von Aflatoxinen, auch von Aflatoxin B1, ist ursprünglich in der Verordnung (EG) 466/2001 der Kommission vom 8. März 2001 zur "Festsetzung der Höchstgehalte für bestimmte Kontaminanten in Lebensmitteln" (mehrfach aktualisiert) festgelegt. Um diese Höchstmengen europaweit einheitlich zu untersuchen, sind Europäische Normen erforderlich. Diese Europäische Norm legt ein Verfahren zur Bestimmung von Aflatoxin B1 in Säuglingsnahrung durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) mit Reinigung an einer Immunoaffinitätssäule und Fluorezenzdetektion fest. Dieses Verfahren wurde in einem Ringversuch durch die Untersuchung von natürlich kontaminierten Proben und aufgestockten Proben mit Gehalten von 0,07 µg/kg bis 0,18 µg/kg validiert. Die Einwaage wird mit einem Gemisch aus Methanol und Wasser extrahiert. Das Extrakt wird filtriert, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS Puffer) auf eine festgelegte Lösemittelkonzentration verdünnt und auf eine Immunoaffinitätssäule aufgebracht, die spezifische Antikörper gegen Aflatoxin B1 enthält. Aflatoxin B1 wird an der Säule isoliert, gereinigt, konzentriert, und anschließend mit Methanol als Elutionsmittel freigesetzt. Aflatoxin B1 wird quantitativ durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (en: reverse-phase high performance liquid chromatography, RP HPLC) mit Nachsäulenderivatisierung (en: post column derivatision, PCD) einschließlich Bromierung und anschließender Fluoreszenzdetektion bestimmt. Die PCD erfolgt entweder mit elektrochemisch erzeugtem Brom oder mit Pyridiniumhydrobromid-Perbromid (PBPB). Das zuständige europäische Arbeitsgremium ist die WG 5 "Biotoxine" des CEN/TC 275 "Lebensmittelanalytik - Horizontale Verfahren" (Sekretariat: DIN). Auf nationaler Ebene ist der Arbeitsausschuss NA 057-01-03 AA "Biotoxine" des NAL verantwortlich.
